Стерилизация VHP · Валидация

Почему споры служат эталоном: G. stearothermophilus и D-значения при VHP

Fenggu Pharmaceutical Equipment · Стерилизация VHP и контроль контаминации

Каждый цикл VHP на фармацевтическом предприятии оценивают по небольшому стальному диску, содержащему около миллиона бактериальных спор. Если после цикла эти споры не дают роста, цикл считается прошедшим проверку. Это руководство посвящено самому биологическому индикатору: почему один микроорганизм, Geobacillus stearothermophilus, стал эталоном, что означают числа в сертификате биологического индикатора, как рассчитывают D-значения и логарифмическое снижение числа спор и что делать, если индикатор даёт рост, когда его быть не должно.

Что такое биологический индикатор для VHP

Биологический индикатор (БИ) для VHP — это носитель, обычно небольшой диск из нержавеющей стали, инокулированный известным количеством бактериальных спор, как правило 10⁶ Geobacillus stearothermophilus, и упакованный в пакет, который пропускает пары перекиси водорода, но не пропускает другие микроорганизмы. После воздействия носитель переносят в питательную среду и инкубируют. Отсутствие роста означает, что споры на этом носителе были инактивированы.

О размещении индикаторов и принципе метода половинного цикла см. как валидируется цикл VHP. Эта статья посвящена самому индикатору.

Почему споры и почему именно этот микроорганизм

Бактериальные споры относятся к наиболее устойчивым к перекиси водорода микроорганизмам. Их оболочка, обезвоженная сердцевина и защищённая ДНК замедляют окисление, которое быстро уничтожает другие клетки. О химических механизмах см. как перекись водорода уничтожает микроорганизмы.

G. stearothermophilus используют по нескольким практическим причинам:

Высокая устойчивость к парам перекиси водорода по сравнению с другими исследованными спорообразующими микроорганизмами, поэтому цикл, инактивирующий его, имеет запас по отношению к менее устойчивым микроорганизмам.
Рост при 55–60 °C. Большинство микроорганизмов окружающей среды растёт при 30–35 °C, поэтому случайная контаминация реже вызывает ложноположительный результат.
Он не является патогеном человека, поэтому с индикаторами можно работать в обычных лабораториях.
Его свойства хорошо изучены и он доступен в виде стандартизованных коммерческих индикаторов с документально подтверждённой устойчивостью.

Устройство индикатора для VHP

Компонент	Типичный вариант	Почему это важно
Носитель	Диск или тестовая пластинка из нержавеющей стали	Моделирует твёрдые поверхности и не поглощает перекись водорода. Бумажные и волокнистые носители поглощают перекись и могут вести себя иначе.
Количество спор	Обычно 10⁶ на носитель	Определяет максимальное логарифмическое снижение, которое может показать один индикатор.
Первичный пакет	Нетканый полиолефин (например, Tyvek) с одной стороны	Пропускает пары и защищает носитель от контаминации до и после воздействия.
Среда для восстановления	Питательная среда, часто с цветовым индикатором pH	Выявляет рост по помутнению или изменению цвета после инкубации.

Как читать сертификат БИ

Каждая партия индикаторов сопровождается сертификатом. Перед применением проверьте следующее:

Параметр	Что проверить
Микроорганизм и штамм	G. stearothermophilus с номером коллекции культур.
Номер партии и срок годности	Соответствие имеющимся индикаторам; срок годности не истёк на день применения.
Численность популяции	Заявленное количество на носитель, например 2.1 × 10⁶. ISO 11138-1 предусматривает, что фактическое количество должно находиться в пределах от −50% до +300% от заявленного значения.
D-значение	Значение и точные условия испытания: концентрация перекиси водорода, температура и метод.
Метод испытания	Кривая выживания, метод доли отрицательных результатов или оба метода.
Инкубация	Температура, среда и время, например 55–60 °C в течение до 7 дней.
Хранение	Допустимые пределы температуры и влажности. Хранение вне этих пределов может снизить или повысить устойчивость индикаторов.

D-значение: скорость инактивации

D-значение — это время воздействия, необходимое в заданных условиях для снижения количества спор на 90%, то есть на один логарифмический порядок. Если D-значение индикатора составляет 2 минуты, снижение на 6 log требует около 12 минут в тех же условиях.

В отличие от паровой стерилизации, для VHP нет единого набора стандартных условий испытания устойчивости, используемого всеми производителями. D-значение имеет смысл только вместе с концентрацией и температурой, при которых оно измерено. Два сертификата с разными условиями нельзя сравнивать напрямую. При смене поставщика или партии индикаторов проверяйте, подходит ли заявленная устойчивость для вашего цикла.

Логарифмическое снижение числа спор (SLR)

Логарифмическое снижение числа спор сопоставляет исходную популяцию с выжившими спорами:

SLR = log₁₀(N₀) − log₁₀(N_f)

N₀ — количество спор на носителе до воздействия, а N_f — количество выживших спор. Если выживших спор нет, результат можно указывать только как больше или равный log₁₀(N₀). При 2.1 × 10⁶ спор и отсутствии роста индикатор показывает SLR не менее 6.3. Поэтому популяцию 10⁶ используют для подтверждения снижения на 6 log.

Расчёт D-значения по доле отрицательных результатов

Если часть индикаторов в группе даёт рост, а часть — нет, D-значение можно оценить методом Stumbo-Murphy-Cochran:

D = U / (log₁₀N₀ − log₁₀(ln(n/r)))

U — время воздействия, n — число подвергнутых воздействию индикаторов, r — число индикаторов без роста. Пример расчёта:

Параметр	Значение
Популяция N₀	1.5 × 10⁶ (log₁₀ = 6.18)
Время воздействия U	10 минут
Число подвергнутых воздействию индикаторов n	10
Отсутствие роста r	4
ln(n/r)	ln(2.5) = 0.916; log₁₀ = −0.04
D-значение	10 / (6.18 + 0.04) ≈ 1.6 минуты

Такие расчёты применяют при испытаниях устойчивости и разработке цикла. При рутинной валидации вопрос обычно проще: отсутствовал ли рост у каждого индикатора в каждой точке?

Если индикатор даёт рост

Положительный индикатор в валидационном цикле требует расследования до принятия или отклонения результата. Типичные этапы:

Идентифицируйте микроорганизм. Если это не G. stearothermophilus, рост вызван контаминацией при обращении с индикатором, и технику переноса следует пересмотреть.
Проверьте место размещения. Холодная точка, экранированный угол или расположенная рядом впитывающая поверхность могут уменьшить воздействие. Повторные положительные результаты в одном месте указывают на реальную проблему распределения.
Проверьте индикатор. Повреждённые пакеты, скопления спор или партия с необычно высокой устойчивостью могут привести к отдельным выжившим спорам, иногда называемым аномально устойчивыми.
Проверьте контроли. Не подвергнутый воздействию индикатор из той же партии должен дать рост, а неинокулированная среда должна остаться прозрачной.

Нельзя просто повторять испытание положительного индикатора до получения приемлемого результата. Расследование и его выводы входят в документацию по валидации.

Правильное обращение с индикаторами

Храните индикаторы согласно сертификату и используйте до истечения срока годности.
Регистрируйте расположение каждого индикатора на схеме или с помощью нумерованных позиций.
Асептически переносите подвергнутые воздействию носители в среду, желательно в ламинарном шкафу.
Перед регистрацией отрицательного результата выдерживайте полное время инкубации, указанное производителем.
С каждой серией используйте положительный контроль из той же партии.

Химические и ферментные индикаторы могут быстрее давать информацию при разработке цикла, но не заменяют биологические индикаторы. См. химические, ферментные и биологические индикаторы для VHP.

Fenggu Передаточный бокс VHP — Квалификацию циклов передаточных окон VHP проводят с биологическими индикаторами, размещёнными на загрузке и на поверхностях камеры с наихудшими условиями.

Оборудование VHP Fenggu

Оборудование Fenggu для VHP, включая мобильные стерилизаторы помещений VHP, системы VHP, интегрированные с ОВК, передаточные окна VHP и стерилизатор VHP BIBO, поддерживает разработку и валидацию циклов с целевым снижением не менее чем на 6 log количества спор Geobacillus stearothermophilus. Фактическую эффективность устанавливают протокол и отчёт по валидации для каждого проекта. Fenggu обеспечивает пусконаладку на месте и обучение операторов поставляемого оборудования.

Всё оборудование VHP: стерилизаторы и генераторы VHP.

Частые вопросы

Почему численность популяции составляет 10⁶?
Индикатор может подтвердить лишь столько логарифмических порядков снижения, сколько позволяет его исходная популяция. Около миллиона спор позволяет одному индикатору показать снижение на 6 log.

Можно ли сравнивать D-значения двух поставщиков?
Только если они измерены в одинаковых условиях. D-значения для VHP сильно зависят от концентрации и температуры, а поставщики используют разные условия испытаний.

Почему для VHP предпочтительны носители из нержавеющей стали?
Они моделируют деконтаминируемые твёрдые поверхности и не поглощают перекись водорода. Впитывающие носители могут поглощать перекись и изменять результат.

Как долго следует инкубировать индикаторы?
Согласно указаниям производителя индикаторов, обычно при 55–60 °C в течение до 7 дней. Слишком ранняя регистрация отрицательного результата может не выявить медленнорастущие выжившие микроорганизмы.

Означает ли один положительный индикатор неудачный цикл?
Не автоматически, но требуется расследование. Если микроорганизм — G. stearothermophilus и причина не в ошибке обращения, необходимо проверить цикл или распределение в этой точке.

Литература

Стандарт на биологические индикаторы: ISO 11138-1:2017, Sterilization of health care products — Biological indicators — Часть 1: General requirements
ISO 11138-7:2019, Sterilization of health care products — Biological indicators — Part 7: Guidance for the selection, use and interpretation of results
USP <55> Biological Indicators — Resistance Performance Tests
USP <1229.5> Biological Indicators for Sterilization
PDA Technical Report No. 51: Biological Indicators for Gas and Vapor-Phase Decontamination Processes