Esterilização VHP · Validação

Porque são as esporas a referência: G. stearothermophilus e valores D em VHP

Fenggu Pharmaceutical Equipment · Esterilização VHP e controlo da contaminação

Cada ciclo VHP numa unidade farmacêutica é avaliado através de um pequeno disco de aço com cerca de um milhão de esporas bacterianas. Se essas esporas não apresentarem crescimento após o ciclo, o ciclo passa no ensaio. Este guia centra-se no próprio indicador biológico: porque é que um microrganismo, Geobacillus stearothermophilus, se tornou a referência, o que significam os números no certificado de um indicador biológico, como se calculam os valores D e as reduções logarítmicas de esporas, e o que fazer quando um indicador apresenta crescimento quando não deveria.

O que é um indicador biológico para VHP

Um indicador biológico (IB) para VHP é um suporte, normalmente um pequeno disco de aço inoxidável, inoculado com uma população conhecida de esporas bacterianas, habitualmente 10⁶ Geobacillus stearothermophilus, e acondicionado numa bolsa que permite a entrada de vapor de peróxido de hidrogénio, mas impede a entrada de outros microrganismos. Após a exposição, o suporte é transferido para um meio de cultura e incubado. A ausência de crescimento significa que as esporas nesse suporte foram inativadas.

Para saber onde colocar os indicadores e como funciona o método de meio ciclo, consulte como se valida um ciclo VHP. Este artigo centra-se no próprio indicador.

Porquê esporas e porquê este microrganismo

As esporas bacterianas estão entre os microrganismos mais resistentes ao peróxido de hidrogénio. O seu revestimento, núcleo desidratado e ADN protegido atrasam a oxidação que destrói rapidamente outras células. Para conhecer a química deste processo, consulte como o peróxido de hidrogénio destrói microrganismos.

G. stearothermophilus é utilizado por várias razões práticas:

Elevada resistência ao vapor de peróxido de hidrogénio em comparação com outros microrganismos formadores de esporas ensaiados, pelo que um ciclo que o inativa tem margem para microrganismos menos resistentes.
Cresce a 55–60 °C. A maioria dos contaminantes ambientais cresce a 30–35 °C, pelo que é menos provável um falso positivo devido a um contaminante acidental.
Não é um agente patogénico humano, pelo que os indicadores podem ser manuseados em laboratórios convencionais.
Está bem caracterizado e encontra-se disponível sob a forma de indicadores comerciais normalizados com resistência documentada.

Como é constituído um indicador para VHP

Componente	Opção habitual	Porque é importante
Suporte	Disco ou provete de aço inoxidável	Representa superfícies duras e não absorve peróxido de hidrogénio. Os suportes de papel e fibra absorvem peróxido e podem comportar-se de forma diferente.
População de esporas	Normalmente 10⁶ por suporte	Define a redução logarítmica máxima que um único indicador pode demonstrar.
Bolsa primária	Poliolefina não tecida por fiação direta (por exemplo, Tyvek) numa das faces	Deixa passar o vapor e protege o suporte da contaminação antes e depois da exposição.
Meio de recuperação	Meio de cultura, frequentemente com um indicador de cor de pH	Revela crescimento através de turvação ou mudança de cor após a incubação.

Como interpretar um certificado de IB

Cada lote de indicadores é acompanhado de um certificado. Verifique estes pontos antes da utilização:

Parâmetro	O que verificar
Microrganismo e estirpe	G. stearothermophilus com um número de coleção de culturas.
Número de lote e prazo de validade	Correspondência com os indicadores disponíveis; prazo de validade não ultrapassado no dia da utilização.
População	Contagem declarada por suporte, por exemplo 2.1 × 10⁶. A ISO 11138-1 prevê que a contagem real se situe entre −50% e +300% do valor declarado.
Valor D	O valor e as condições exatas do ensaio: concentração de peróxido de hidrogénio, temperatura e método.
Método de ensaio	Curva de sobrevivência, fração negativa ou ambos.
Incubação	Temperatura, meio e tempo, por exemplo 55–60 °C durante um máximo de 7 dias.
Armazenamento	Limites de temperatura e humidade. Os indicadores armazenados fora desses limites podem perder ou ganhar resistência.

Valor D: a velocidade de inativação

O valor D é o tempo de exposição necessário, em condições especificadas, para reduzir uma população de esporas em 90%, ou seja, uma ordem logarítmica. Se um indicador tiver um valor D de 2 minutos, uma redução de 6 log exige cerca de 12 minutos nas mesmas condições.

Ao contrário da esterilização por vapor, o VHP não tem um conjunto único de condições normalizadas de ensaio de resistência utilizado por todos os fabricantes. Um valor D só tem significado em conjunto com a concentração e a temperatura a que foi medido. Dois certificados com condições diferentes não podem ser comparados diretamente. Ao mudar de fornecedor ou de lote de indicadores, verifique se a resistência declarada continua a ser adequada ao ciclo.

Redução logarítmica de esporas (SLR)

A redução logarítmica de esporas compara a população inicial com as sobreviventes:

SLR = log₁₀(N₀) − log₁₀(N_f)

N₀ é a população no suporte antes da exposição e N_f o número de sobreviventes. Quando nenhuma espora sobrevive, o resultado só pode ser apresentado como superior ou igual a log₁₀(N₀). Com 2.1 × 10⁶ esporas e sem crescimento, o indicador demonstra uma SLR de pelo menos 6.3. É por isso que uma população de 10⁶ é utilizada para demonstrar uma redução de 6 log.

Cálculo de um valor D a partir de resultados de fração negativa

Quando alguns indicadores de um grupo apresentam crescimento e outros não, o valor D pode ser estimado pelo método Stumbo-Murphy-Cochran:

D = U / (log₁₀N₀ − log₁₀(ln(n/r)))

U é o tempo de exposição, n o número de indicadores expostos e r o número que não apresentou crescimento. Exemplo de cálculo:

Dado	Valor
População N₀	1.5 × 10⁶ (log₁₀ = 6.18)
Tempo de exposição U	10 minutos
Indicadores expostos n	10
Sem crescimento r	4
ln(n/r)	ln(2.5) = 0.916; log₁₀ = −0.04
Valor D	10 / (6.18 + 0.04) ≈ 1.6 minutos

Estes cálculos são utilizados nos ensaios de resistência e no desenvolvimento do ciclo. Na validação de rotina, a pergunta habitual é mais simples: todos os indicadores em todas as localizações apresentaram ausência de crescimento?

Quando um indicador apresenta crescimento

Um indicador positivo num ciclo de validação deve ser investigado antes de o resultado ser aceite ou rejeitado. Etapas habituais:

Identificar o microrganismo. Se não for G. stearothermophilus, o crescimento resultou de contaminação durante o manuseamento e a técnica de transferência deve ser revista.
Verificar a localização. Um ponto frio, um canto protegido da exposição ou uma superfície absorvente próxima podem reduzir a exposição. Resultados positivos repetidos no mesmo local apontam para um problema real de distribuição.
Verificar o indicador. Bolsas danificadas, esporas aglomeradas ou um lote com resistência invulgarmente elevada podem originar sobreviventes isolados, por vezes designados atípicos.
Verificar os controlos. Um indicador não exposto do mesmo lote deve apresentar crescimento, e o meio não inoculado deve permanecer límpido.

Um resultado positivo não deve simplesmente ser repetido até se obter aprovação. A investigação e a sua conclusão fazem parte do registo de validação.

Manuseamento correto dos indicadores

Armazene os indicadores conforme indicado no certificado e utilize-os antes do fim do prazo de validade.
Registe a localização de cada indicador num mapa ou através de posições numeradas.
Transfira os suportes expostos para o meio de forma assética, idealmente numa câmara de fluxo laminar.
Incube durante todo o tempo indicado pelo fabricante antes de registar um resultado negativo.
Inclua um controlo positivo do mesmo lote em cada série.

Os indicadores químicos e enzimáticos podem fornecer informação mais rápida durante o desenvolvimento do ciclo, mas não substituem os indicadores biológicos. Consulte indicadores químicos, enzimáticos e biológicos para VHP.

Fenggu VHP pass box — Os ciclos dos pass box VHP são qualificados com indicadores biológicos colocados na carga e nas superfícies da câmara que representam o pior caso.

Equipamento VHP Fenggu

O equipamento VHP Fenggu, incluindo esterilizadores VHP móveis para salas, sistemas VHP integrados no AVAC, pass boxes VHP e o esterilizador VHP BIBO, apoia o desenvolvimento e a validação de ciclos com um objetivo de redução de pelo menos 6 log de Geobacillus stearothermophilus. A eficácia real é estabelecida pelo protocolo e pelo relatório de validação de cada projeto. A Fenggu fornece colocação em serviço no local e formação de operadores para o equipamento que fornece.

Todos os equipamentos VHP: esterilizadores e geradores VHP.

Perguntas frequentes

Porque é a população de 10⁶?
Um indicador só pode demonstrar tantas ordens logarítmicas de redução quantas a sua população inicial permitir. Uma população de cerca de um milhão de esporas permite que um único indicador demonstre uma redução de 6 log.

Posso comparar valores D de dois fornecedores?
Apenas se tiverem sido medidos nas mesmas condições. Os valores D de VHP dependem fortemente da concentração e da temperatura, e os fornecedores não utilizam todos as mesmas condições de ensaio.

Porque são preferidos os suportes de aço inoxidável para VHP?
Representam as superfícies duras a descontaminar e não absorvem peróxido de hidrogénio. Os suportes absorventes podem reter peróxido e alterar o resultado.

Durante quanto tempo devem os indicadores ser incubados?
Conforme indicado pelo fabricante do indicador, habitualmente a 55–60 °C durante um máximo de 7 dias. Registar um resultado negativo demasiado cedo pode impedir a deteção de sobreviventes de crescimento lento.

Um único indicador positivo significa que o ciclo falhou?
Não automaticamente, mas deve ser investigado. Se o microrganismo for G. stearothermophilus e a causa não for um erro de manuseamento, o ciclo ou a distribuição nessa localização requer atenção.

Referências

Norma sobre indicadores biológicos: ISO 11138-1:2017, Sterilization of health care products — Biological indicators — Parte 1: General requirements
ISO 11138-7:2019, Sterilization of health care products — Biological indicators — Part 7: Guidance for the selection, use and interpretation of results
USP <55> Biological Indicators — Resistance Performance Tests
USP <1229.5> Biological Indicators for Sterilization
PDA Technical Report No. 51: Biological Indicators for Gas and Vapor-Phase Decontamination Processes