Esterilização VHP · Princípios

Como o peróxido de hidrogénio elimina microrganismos: o mecanismo de oxidação do VHP

Fenggu Pharmaceutical Equipment · Esterilização VHP e controlo da contaminação

O peróxido de hidrogénio vaporizado (VHP) é utilizado para descontaminar isoladores, salas limpas e laboratórios porque elimina um leque muito vasto de microrganismos, incluindo esporos bacterianos, e depois se decompõe em água e oxigénio. Compreender como os elimina ajuda a explicar a conceção dos ciclos: por que são importantes a concentração e o tempo de contacto, por que se limpam primeiro as salas, por que se controla a condensação e por que se utilizam esporos para demonstrar que um ciclo funciona.

A resposta breve

O peróxido de hidrogénio elimina microrganismos por oxidação. Tanto este composto como as espécies reativas que gera, sobretudo radicais hidroxilo, retiram eletrões aos lípidos da membrana, às proteínas e ao ADN. Quando um número suficiente destas estruturas está danificado, a célula deixa de conseguir funcionar ou multiplicar-se. Como ataca muitos alvos em simultâneo, os microrganismos não desenvolvem uma resistência específica a este composto como podem desenvolver a um antibiótico.

A química

O peróxido de hidrogénio (H₂O₂) é um oxidante. Por si só, reage diretamente com alguns componentes celulares, mas grande parte dos danos resulta do que produz no interior da célula. As células contêm pequenas quantidades de ferro e cobre livres. Estes metais reagem com o peróxido de hidrogénio na reação de Fenton:

Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + OH⁻ + •OH

O radical hidroxilo (•OH) é uma das espécies químicas mais reativas conhecidas. Dura apenas uma fração ínfima de segundo e reage com quase tudo o que está próximo. Como os radicais se formam perto de iões metálicos ligados ao ADN e às proteínas, causam danos precisamente nos locais mais críticos.

O que é danificado

Alvo	O que acontece	Resultado para a célula
Lípidos da membrana	Peroxidação lipídica: os ácidos gordos insaturados são oxidados numa reação em cadeia.	A membrana torna-se permeável e perde o controlo do que entra e sai da célula.
Proteínas e enzimas	Os aminoácidos que contêm enxofre (grupos tiol da cisteína, metionina) são oxidados; as proteínas desenrolam-se ou formam ligações cruzadas.	As enzimas deixam de funcionar; o transporte e a produção de energia falham.
ADN e ARN	As bases são oxidadas e as cadeias quebram-se.	A célula não consegue copiar os seus genes nem reparar-se.
Cápsides e invólucros virais	As proteínas da cápside e os invólucros lipídicos são oxidados.	O vírus deixa de conseguir ligar-se às células hospedeiras ou entrar nelas.
Revestimento do esporo e proteínas de germinação	O revestimento protetor é danificado e as proteínas necessárias à germinação são inativadas.	O esporo não consegue voltar a ser uma célula em crescimento.

Por que são os esporos os mais difíceis de eliminar

Os esporos bacterianos são formas dormentes adaptadas à sobrevivência. Várias características abrandam a ação do peróxido de hidrogénio:

Um espesso revestimento do esporo com várias camadas, que reage com os oxidantes e os absorve antes de chegarem ao núcleo.
Um baixo teor de água no núcleo, que limita as reações químicas no seu interior.
Pequenas proteínas solúveis em ácido (SASPs) que se ligam ao ADN e o protegem.
Uma grande reserva de ácido dipicolínico ligado ao cálcio, que estabiliza o núcleo.

Como os esporos são os organismos mais resistentes que se espera eliminar com VHP, são utilizados para demonstrar a eficácia de um ciclo. Os esporos de Geobacillus stearothermophilus são o indicador biológico habitual para VHP. Se um ciclo eliminar uma população de 10⁶ destes esporos nas localizações de pior caso, espera-se que também elimine aí os organismos menos resistentes. Consulte como se valida um ciclo VHP com indicadores biológicos.

Ordem geral de resistência

A bibliografia sobre desinfeção classifica os microrganismos segundo a dificuldade de os inativar com agentes químicos. Uma ordem simplificada, dos mais aos menos resistentes:

Grupo	Exemplos	Motivo
Esporos bacterianos	Geobacillus, Bacillus, Clostridioides	Revestimento, núcleo seco, ADN protegido
Micobactérias	Mycobacterium de várias espécies	Parede celular cerosa, rica em lípidos
Vírus sem invólucro	Norovírus, adenovírus	Cápside proteica robusta, sem camada lipídica
Fungos	Bolores e os seus esporos, leveduras	Paredes celulares espessas; os esporos dos bolores são resistentes
Bactérias vegetativas	Staphylococcus, E. coli	Em crescimento ativo, menos protegidas
Vírus com invólucro	Vírus da gripe, coronavírus	Invólucro lipídico frágil

Os priões estão fora do âmbito das alegações habituais de descontaminação com VHP e exigem uma avaliação separada.

Catalase, sujidade e biofilme

Muitas bactérias produzem catalase e peroxidase, enzimas que decompõem o peróxido de hidrogénio para proteger a célula das pequenas quantidades produzidas pelo metabolismo normal. Às concentrações utilizadas para descontaminação, estas defesas são ultrapassadas. Continuam a ser importantes onde os organismos estão presentes em grande número ou protegidos:

A sujidade orgânica , como proteínas, sangue ou meios de cultura, reage com o peróxido de hidrogénio e consome-o antes de este chegar aos organismos.
Os biofilmes combinam um elevado número de células, atividade de catalase e uma matriz protetora.

É por isso que o VHP é aplicado em superfícies limpas. É uma etapa final de descontaminação, não um substituto da limpeza.

Vapor ou líquido: onde ocorre a eliminação

Num ciclo VHP, o peróxido de hidrogénio chega sob a forma de vapor. A investigação sugere que grande parte da eliminação ocorre na superfície, onde as moléculas de peróxido de hidrogénio se adsorvem e formam uma camada extremamente fina, muitas vezes invisível, de peróxido de hidrogénio concentrado. É aí que ocorrem as reações de oxidação.

A condensação visível é uma questão diferente. Grandes áreas molhadas tornam a distribuição irregular, podem danificar os materiais e abrandar o arejamento. A conceção do ciclo visa, por isso, uma concentração suficiente nas superfícies sem condensação descontrolada. Para mais informações, consulte Concentração de VHP, humidade e condensação.

O que controla a velocidade de eliminação

Fator	Efeito	Como o ciclo o gere
Concentração	Uma concentração mais elevada na superfície significa uma oxidação mais rápida.	Taxa de injeção e monitorização com um sensor de peróxido de hidrogénio.
Tempo de contacto	A eliminação aumenta com o tempo de exposição a uma determinada concentração.	Uma fase de exposição (manutenção) definida.
Humidade	O vapor de água compete com o peróxido de hidrogénio e desloca o ponto de condensação.	Desumidificação antes da injeção.
Temperatura	Afeta a quantidade de vapor que o ar pode conter e os locais onde condensa; os pontos frios condensam primeiro.	Temperatura estável da sala ou do recinto.
Estado da superfície	A sujidade e o biofilme consomem peróxido de hidrogénio e protegem os organismos.	Limpeza antes da descontaminação.
Materiais e carga	Alguns materiais absorvem ou decompõem o peróxido de hidrogénio.	Configurações de carga ensaiadas durante o desenvolvimento do ciclo.

O tempo necessário para reduzir uma população de esporos em 90% em condições definidas é o valor D. Os fornecedores de indicadores biológicos indicam-no para os seus indicadores, e os responsáveis pelo desenvolvimento dos ciclos utilizam-no para avaliar a margem de um ciclo.

Após a eliminação: água e oxigénio

O peróxido de hidrogénio decompõe-se em água e oxigénio:

2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂

Durante o arejamento, o vapor é removido por ar novo ou passa por um catalisador que acelera esta decomposição. Não ficam substâncias tóxicas nas superfícies, o que é uma das principais razões pelas quais o VHP substituiu o formaldeído em muitas instalações. As pessoas só podem voltar a entrar quando a concentração medida estiver abaixo do limite de exposição profissional, por exemplo 1 ppm como média de 8 horas segundo a OSHA nos EUA. Para saber como os geradores gerem cada fase, consulte como funciona um gerador VHP.

O que isto significa para a conceção do ciclo

Limpar primeiro. A sujidade e os resíduos consomem peróxido de hidrogénio e protegem os organismos.
Secar o ar. A desumidificação deixa margem para o vapor de peróxido de hidrogénio antes de começar a condensação.
Medir, sem presumir. A concentração na superfície e o tempo a essa concentração determinam o resultado.
Comprovar com esporos. Os indicadores biológicos nas localizações de pior caso mostram se o ciclo funciona no seu espaço.
Arejar até um ponto final medido. A reentrada baseia-se numa leitura, não no tempo decorrido.

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Perguntas frequentes

Os microrganismos podem tornar-se resistentes ao peróxido de hidrogénio?
Alguns organismos toleram-no melhor do que outros, por exemplo através da catalase ou do biofilme. Como danifica muitas estruturas celulares em simultâneo, a resistência adquirida específica do tipo observado com os antibióticos não é uma preocupação prática às concentrações de descontaminação.

Por que se utilizam esporos para validar os ciclos VHP?
Estão entre os organismos mais resistentes ao peróxido de hidrogénio. Se um ciclo eliminar 10⁶ Geobacillus stearothermophilus na forma de esporos nas localizações de pior caso, espera-se que também elimine aí os organismos menos resistentes.

O vapor é mais eficaz do que o peróxido de hidrogénio líquido?
O vapor chega às superfícies de forma mais uniforme, incluindo as zonas sombreadas, e deixa menos humidade. Em ambos os casos, a eficácia depende da concentração e do tempo de contacto na superfície.

O VHP deixa resíduos?
O peróxido de hidrogénio decompõe-se em água e oxigénio. Após o arejamento, mede-se a concentração para confirmar que está abaixo do limite de exposição antes da reentrada.

O peróxido de hidrogénio elimina vírus?
Sim, tanto vírus com invólucro como sem invólucro, oxidando os seus invólucros e as proteínas das cápsides. Os vírus sem invólucro são mais resistentes do que os vírus com invólucro.

Referências

McDonnell G, Russell AD. Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance. Clinical Microbiology Reviews. 1999;12(1):147–179.
Linley E, Denyer SP, McDonnell G, Simons C, Maillard JY. Use of hydrogen peroxide as a biocide: new consideration of its mechanisms of biocidal action. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2012;67(7):1589–1596.
Setlow P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. Journal of Applied Microbiology. 2006;101(3):514–525.
Norma sobre indicadores biológicos: ISO 11138-1:2017, Sterilization of health care products — Biological indicators — Parte 1: General requirements
USP <1229.11> Vapor Phase Sterilization