Stérilisation VHP · Validation

Pourquoi les spores servent de référence : G. stearothermophilus et les valeurs D en VHP

Fenggu Pharmaceutical Equipment · Stérilisation VHP et maîtrise de la contamination

Chaque cycle VHP dans une usine pharmaceutique est évalué à l’aide d’un petit disque en acier portant environ un million de spores bactériennes. Si ces spores ne se développent pas après le cycle, celui-ci satisfait au critère. Ce guide porte sur l’indicateur biologique lui-même : pourquoi un microorganisme, Geobacillus stearothermophilus, est devenu la référence, ce que signifient les chiffres du certificat d’un indicateur biologique, comment calculer les valeurs D et les réductions logarithmiques des spores, et que faire lorsqu’un indicateur présente une croissance alors qu’il ne le devrait pas.

Qu’est-ce qu’un indicateur biologique pour VHP ?

Un indicateur biologique (IB) pour VHP est un support, généralement un petit disque en acier inoxydable, inoculé avec une population connue de spores bactériennes, habituellement 10⁶ Geobacillus stearothermophilus, et conditionné dans un sachet qui laisse entrer la vapeur de peroxyde d’hydrogène mais empêche l’entrée d’autres microorganismes. Après exposition, le support est transféré dans un milieu de culture et incubé. L’absence de croissance signifie que les spores présentes sur ce support ont été inactivées.

Pour savoir où placer les indicateurs et comment fonctionne la méthode du demi-cycle, voir comment un cycle VHP est validé. Cet article porte sur l’indicateur lui-même.

Pourquoi des spores et pourquoi ce microorganisme ?

Les spores bactériennes comptent parmi les microorganismes les plus résistants au peroxyde d’hydrogène. Leur enveloppe, leur cœur déshydraté et leur ADN protégé ralentissent l’oxydation qui détruit rapidement les autres cellules. Pour comprendre les mécanismes chimiques, voir comment le peroxyde d’hydrogène détruit les microorganismes.

G. stearothermophilus est utilisé pour plusieurs raisons pratiques :

Une forte résistance à la vapeur de peroxyde d’hydrogène par rapport aux autres microorganismes sporulants testés, ce qui donne à un cycle qui l’inactive une marge vis-à-vis des microorganismes moins résistants.
Il se développe à 55–60 °C. La plupart des contaminants environnementaux se développent à 30–35 °C, ce qui réduit le risque de faux positif dû à un contaminant accidentel.
Ce n’est pas un agent pathogène humain, les indicateurs peuvent donc être manipulés dans des laboratoires courants.
Il est bien caractérisé et disponible sous forme d’indicateurs commerciaux standardisés dont la résistance est documentée.

Constitution d’un indicateur pour VHP

Élément	Choix courant	Pourquoi elle compte
Support	Disque ou éprouvette en acier inoxydable	Représente les surfaces dures et n’absorbe pas le peroxyde d’hydrogène. Les supports en papier et en fibres absorbent le peroxyde et peuvent se comporter différemment.
Population de spores	Généralement 10⁶ par support	Détermine la réduction logarithmique maximale qu’un seul indicateur peut démontrer.
Sachet primaire	Polyoléfine non tissée par filage direct (par exemple Tyvek) sur une face	Laisse passer la vapeur tout en protégeant le support de la contamination avant et après exposition.
Milieu de récupération	Milieu de culture, souvent avec un indicateur coloré de pH	Révèle la croissance par une turbidité ou un changement de couleur après incubation.

Lire un certificat d’IB

Chaque lot d’indicateurs est accompagné d’un certificat. Vérifier ces points avant utilisation :

Paramètre	Points à vérifier
Microorganisme et souche	G. stearothermophilus avec un numéro de collection de cultures.
Numéro de lot et date de péremption	Correspondance avec les indicateurs disponibles ; date de péremption non dépassée le jour de l’utilisation.
Population	Nombre déclaré par support, par exemple 2.1 × 10⁶. ISO 11138-1 prévoit que le nombre réel se situe entre −50% et +300% de la valeur déclarée.
Valeur D	La valeur et les conditions exactes de l’essai : concentration en peroxyde d’hydrogène, température et méthode.
Méthode d’essai	Courbe de survie, fraction négative, ou les deux.
Incubation	Température, milieu et durée, par exemple 55–60 °C pendant une durée allant jusqu’à 7 jours.
Stockage	Limites de température et d’humidité. Les indicateurs stockés hors de ces limites peuvent perdre ou gagner en résistance.

Valeur D : la vitesse d’inactivation

La valeur D est la durée d’exposition nécessaire, dans des conditions spécifiées, pour réduire une population de spores de 90%, soit d’un ordre logarithmique. Si un indicateur a une valeur D de 2 minutes, une réduction de 6 log nécessite environ 12 minutes dans les mêmes conditions.

Contrairement à la stérilisation à la vapeur, le VHP ne dispose pas d’un ensemble unique de conditions normalisées d’essai de résistance utilisé par tous les fabricants. Une valeur D n’a de sens qu’avec la concentration et la température auxquelles elle a été mesurée. Deux certificats établis dans des conditions différentes ne peuvent pas être comparés directement. En cas de changement de fournisseur ou de lot d’indicateurs, vérifier que la résistance déclarée convient toujours au cycle.

Réduction logarithmique des spores (SLR)

La réduction logarithmique des spores compare la population initiale aux survivants :

SLR = log₁₀(N₀) − log₁₀(N_f)

N₀ est la population présente sur le support avant exposition et N_f le nombre de survivants. Lorsqu’aucune spore ne survit, le résultat ne peut être exprimé que comme supérieur ou égal à log₁₀(N₀). Avec 2.1 × 10⁶ spores et aucune croissance, l’indicateur démontre une SLR d’au moins 6.3. C’est pourquoi une population de 10⁶ est utilisée pour démontrer une réduction de 6 log.

Calculer une valeur D à partir de résultats de fraction négative

Lorsque certains indicateurs d’un groupe présentent une croissance et d’autres non, la valeur D peut être estimée par la méthode Stumbo-Murphy-Cochran :

D = U / (log₁₀N₀ − log₁₀(ln(n/r)))

U est la durée d’exposition, n le nombre d’indicateurs exposés et r le nombre d’indicateurs sans croissance. Exemple de calcul :

Donnée	Valeur
Population N₀	1.5 × 10⁶ (log₁₀ = 6.18)
Durée d’exposition U	10 minutes
Indicateurs exposés n	10
Absence de croissance r	4
ln(n/r)	ln(2.5) = 0.916; log₁₀ = −0.04
Valeur D	10 / (6.18 + 0.04) ≈ 1.6 minutes

Ces calculs sont utilisés lors des essais de résistance et du développement du cycle. En validation courante, la question est généralement plus simple : tous les indicateurs, à tous les emplacements, ont-ils montré une absence de croissance ?

Lorsqu’un indicateur présente une croissance

Un indicateur positif lors d’un cycle de validation doit faire l’objet d’une investigation avant que le résultat soit accepté ou rejeté. Étapes habituelles :

Identifier le microorganisme. S’il ne s’agit pas de G. stearothermophilus, la croissance provient d’une contamination lors de la manipulation, et la technique de transfert doit être revue.
Vérifier l’emplacement. Un point froid, un angle masqué ou une surface absorbante à proximité peuvent réduire l’exposition. Des résultats positifs répétés au même endroit indiquent un réel problème de distribution.
Vérifier l’indicateur. Des sachets endommagés, des amas de spores ou un lot présentant une résistance inhabituellement élevée peuvent entraîner des survivants isolés, parfois qualifiés d’atypiques.
Vérifier les témoins. Un indicateur non exposé du même lot doit présenter une croissance, tandis que le milieu non inoculé doit rester limpide.

Un résultat positif ne doit pas simplement être répété jusqu’à obtenir un résultat conforme. L’investigation et sa conclusion font partie du dossier de validation.

Manipuler correctement les indicateurs

Stocker les indicateurs conformément au certificat et les utiliser avant leur date de péremption.
Consigner l’emplacement de chaque indicateur sur un plan ou à l’aide de positions numérotées.
Transférer les supports exposés dans le milieu de manière aseptique, idéalement sous une hotte à flux laminaire.
Respecter toute la durée d’incubation indiquée par le fabricant avant de consigner un résultat négatif.
Inclure un témoin positif du même lot dans chaque série.

Les indicateurs chimiques et enzymatiques peuvent fournir des informations plus rapidement pendant le développement du cycle, mais ils ne remplacent pas les indicateurs biologiques. Voir les indicateurs chimiques, enzymatiques et biologiques pour VHP.

Fenggu VHP pass box — Les cycles des sas de transfert VHP sont qualifiés à l’aide d’indicateurs biologiques placés sur la charge et sur les surfaces de la chambre présentant les conditions les plus défavorables.

Équipements VHP Fenggu

Les équipements VHP Fenggu, notamment les des stérilisateurs VHP mobiles pour salles, systèmes VHP intégrés au CVC, sas de transfert VHP et le stérilisateur VHP BIBO, permettent de développer et de valider les cycles avec un objectif de réduction d’au moins 6 log de Geobacillus stearothermophilus. L’efficacité réelle est établie par le protocole et le rapport de validation de chaque projet. Fenggu assure la mise en service sur site et la formation des opérateurs pour les équipements fournis.

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Questions fréquentes

Pourquoi la population est-elle de 10⁶?
Un indicateur ne peut démontrer qu’un nombre d’ordres logarithmiques de réduction correspondant à sa population initiale. Une population d’environ un million de spores permet à un seul indicateur de démontrer une réduction de 6 log.

Peut-on comparer les valeurs D de deux fournisseurs ?
Uniquement si elles ont été mesurées dans les mêmes conditions. Les valeurs D du VHP dépendent fortement de la concentration et de la température, et les fournisseurs n’utilisent pas tous les mêmes conditions d’essai.

Pourquoi privilégier les supports en acier inoxydable pour le VHP ?
Ils représentent les surfaces dures à décontaminer et n’absorbent pas le peroxyde d’hydrogène. Les supports absorbants peuvent retenir le peroxyde et modifier le résultat.

Combien de temps faut-il incuber les indicateurs ?
Selon les indications du fabricant, généralement à 55–60 °C pendant une durée allant jusqu’à 7 jours. Consigner un résultat négatif trop tôt peut empêcher la détection de survivants à croissance lente.

Un seul indicateur positif signifie-t-il que le cycle a échoué ?
Pas automatiquement, mais une investigation est nécessaire. Si le microorganisme est G. stearothermophilus et que la cause n’est pas une erreur de manipulation, le cycle ou la distribution à cet emplacement doit être examiné.

Références

Norme sur les indicateurs biologiques : ISO 11138-1:2017, Sterilization of health care products — Biological indicators — Partie 1 : General requirements
ISO 11138-7:2019, Sterilization of health care products — Biological indicators — Part 7: Guidance for the selection, use and interpretation of results
USP <55> Biological Indicators — Resistance Performance Tests
USP <1229.5> Biological Indicators for Sterilization
PDA Technical Report No. 51: Biological Indicators for Gas and Vapor-Phase Decontamination Processes